Como funciona a PCR em tempo real?

Fala biomédico, beleza? Você sabe como funciona a técnica de PCR em tempo real? E não estou falando da proteína c reativa não em! A sigla PCR vem do inglês e significa reação em cadeia da polimerase e é uma técnica muito utilizada na biologia molecular para detecção e quantificação de ácidos nucleicos, como o DNA e o RNA. Nesse texto vamos explorar como essa técnica funciona e em quais situações ela é aplicada.

Já te adianto que durante a pandemia da COVID-19, a PCR em tempo real foi amplamente utilizada para quantificar o material genético do SARS-CoV-2.

Tá, mas como isso é possível?

Em resumo, a PCR em tempo real nada mais é do que uma variação da PCR convencional que permite a amplificação e a quantificação simultânea do DNA ou RNA de interesse. Por tanto, ainda usando o exemplo da COVID, obtinha-se uma amostra, no caso o swab nasal/faríngeo e vericava-se se existia o material genético do vírus SARS-CoV-2 naquela amostra. Isso é possível porque na PCR em tempo real tem-se a amplificação do material genético, ou seja, um aumento do número de cópias desse material genético facilitando sua detecção.

E como funciona tudo isso na prática?

• Na primeira etapa, aquece-se a amostra a uma temperatura elevada (entre 91 e 95°C) para desnaturar o DNA e permitir a separação das duas fitas.
• Em seguida, iniciam-se os ciclo de amplificação à um temperatura mais baixa (entre 50 e 60°C) para aumentar as cópias desse material genético. Para isso, utiliza-se um primer, que consiste em uma sequência específica que irá se ligar a uma região alvo do material genético, flanquando, ou seja, marcando, a região que será amplificada.
• Adiciona-se então a enzima polimerase na reação para sintetizar uma nova fita complementar (à temperatura de 72°C).
• Durante esses ciclos, uma sonda fluorescente se liga ao DNA amplificado. Essa sonda contém um fluoróforo (molécula que emite fluorescência) ligada à ela emitindo um sinal que pode ser detectado e quantificado em tempo real por um aparelho específico.

Desse modo, repete-se esses ciclos de amplificação várias vezes, geralmente de 30 a 40 ciclos, a fim de amplificar exponencialmente a quantidade de material genético-alvo presente na reação.

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A análise dos resultados da PCR em tempo real é realizada por meio de softwares específicos que utilizam algoritmos com o intuito de calcular a quantidade de material genético-alvo presente na amostra. Esses softwares comparam os valores de fluorescência obtidos com curvas-padrão construídas a partir de amostras de referência com concentrações conhecidas do material genético-alvo.

Onde é possível aplicar a PCR em tempo real?

Além do exemplo da COVID, A PCR em tempo real tem uma ampla gama de aplicações em diversas áreas da ciência. Na medicina, por exemplo, é utilizada no diagnóstico de doenças outras infecciosas e na detecção de mutações genéticas associadas a doenças genéticas. Na pesquisa científica, podemos usá-la para estudar a expressão gênica, identificar micro-organismos em amostras ambientais, identificar polimorfismos entre outras aplicações.

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Referências Bibliográficas:

MACKAY, I. M. et al. Real-time PCR in virology, Nucleic Acids Research, v. 30, n. 6, p. 1292–1305, 2002.